扫描电镜研究含水食品真实结构，需要什么样的冷冻样品台？
本帖最后由 小柒啊 于 2017-7-2 19:49 编辑以前提到过如何预防含水样品（如潮湿的食品、水果蔬菜、肉类、奶酪等）在电子显微镜观察过程中释放气体和水蒸气。这些释放的气体和水蒸气对扫描电镜效果的影响非常复杂，除了样品本身的观测可能受到不良影响以外，还有就是会很快恶化电子显微镜的分辨性能。所谓的环境扫描电镜，就是在保证含水样品原貌的基础上，尽可能将各种不利因素消除掉，一般来说成像效果要比传统模式差不少。
样品脱水干燥是防止水蒸气产生的方法；冷冻是另外一种方法；对干燥的或冷冻和冷冻断面的复型也是一种方法。每种方法都有其优点和缺点。
对于冷冻的电镜样品可能需要进一步处理。
冷冻固定的样品常常被宣称无需使用任何化学品，因此人为假象程度被降低。但这个结论在非常特殊的条件下才是正确的-- 只有存在于样品中的水相迅速冷冻形成“玻璃”相。
水的玻璃化是指冷冻速度非常快，以至于没有时间形成冰晶。否则，当冷冻速度慢，生长的冰晶有很大可能会让样品变形失真。 对于纯水，形成玻璃相冰，冷冻速度必须高于1x106K/s，对于生物样品，冷冻速度应该大于1x104K/s。热量只能从样品的表面传到出去，这就意味这，要实现这样的冷冻速度，样品只能是非常薄的表层（厚度小于3微米）。超过玻璃相冰区域，冰晶生长，把样品中的其他成分（单质分子如糖、悬浮颗粒物如酪蛋白颗粒、固体结构如凝结蛋白质或纤维素等）推向旁边，如右图。即使相当小的样品也会发生“慢”冷冻，如2mm直径生物样品放入液氮中。尽管液氮的沸点温度很低，-196℃，但放入其中的任何物体周围都会迅速形成一层氮气，隔离了物体，降低了传热效率。过去的氟利昂、N型正乙烷,现在的液体乙烷，被液氮冷却后，被认为是更好的冷冻剂。多种冷冻方法，特别是高压冷冻已经发展比较成熟。
为了用扫描电镜观察样品内部结构，冷冻样品通常冷冻断裂。冷冻断裂通常在特殊装置中，称做冷冻台cryo-stage，附属于扫描电镜。在冷冻刻蚀期间，经过升华去除一薄层冰层，让固体结构浮现出来。冷冻样品然后喷金。
当前还有一种帕尔贴效应冷冻台，冷却温度最低-30℃，冷却速度很低，直接对新鲜的生物样品冷冻观察，样品只能遭受冰晶损伤。
上图是冰晶生长对冰激凌样品微结构的影响。左图为冰晶生长后的内部显微机构扫描电镜图像， 右图是经过固定脱水冷冻断裂后的内部显微结构。
冰晶的生长严重损伤了显微镜结构，造成图像人工假象。而右图是实际的内部显微结构。
液氮冷冻断裂也可以和传统扫描电镜结合使用，若没有冷台附件，那么过程要稍微麻烦一些，样品需要化学固定，酒精脱水，在液氮中冷冻和冷冻断裂，酒精结冰不会产生晶体，断裂部分在酒精中解冻，临界点干燥，装载如样品杯，喷金，用扫描电镜传统模式观察。这种方法好处很多。
为什么要冷冻断裂？
上图给出答案，干燥的样品直接断裂（上图左），会沿着低强度区断裂，如果物质包含高密度区域，这些区域就无法揭露出来。即使非常均匀的样品，他们的断口也非常粗糙，图像对结构表征也不太适宜。
冷冻断裂的样品，断裂面非常平整，图像很好的表征不同结构的尺度比例。
冷冻断裂在液氮中进行，而且样品中充满100%酒精，样品中没有气泡，冷冻的酒精不会产生晶体，没有严重损伤样品显微结构的风险。在固定前，将样品切成2-3块（1X1X10mm），经完全脱水后，用两个隔热的的针型镊子将样品放入液氮。
http://dn.cailiaoren.com/forum/201705/24/203815vzbt8irm3gy3kkz0.png
页:
[1]