固相萃取技术讲解
固相萃取技术
在过去的二十多年中，固相萃取作为化学分离和纯化的一个强有力工具出现了。从痕量样品的前处理到工业规模的化学分离，吸附剂萃取在制药、精细化工、生物医学、食品分析、有机合成、环境和其他领域起着越来越重要的作用。
■ 固相萃取的原理
在过去的二十多年中，固相萃取作为化学分离和纯化的一个强有力工具出现了。从痕量样品的前处理到工业规模的化学分离，吸附剂萃取在制药、精细化工、生物医学、食品分析、有机合成、环境和其他领域起着越来越重要的作用。 固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取中，固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过吸附剂床时，分离物浓缩在其表面，其他样品成分通过吸附剂床；通过只吸附分离物而不吸附其他样品成分的吸附剂，可以得到高纯度和浓缩的分离物。 保留和洗脱
在固相萃取中最通常的方法是将固体吸附剂装在一个针筒状柱子里，使样品溶液通过吸附剂床，样品中的化合物或通过吸附剂或保留在吸附剂上（依靠吸附剂对溶剂的相对吸附）。“保留”是一种存在于吸附剂和分离物分子间吸引的现象，造成当样品溶液通过吸附剂床时，分离物在吸附剂上不移动。保留是三个因素的作用：分离物、溶剂和吸附剂。所以，一个给定的分离物的保留行为在不同溶剂和吸附剂存在下是变化的。“洗脱”是一种保留在吸附剂上的分离物从吸附剂上去除的过程，这通过加入一种对分离物的吸引比吸附剂更强的溶剂来完成。 容量和选择性 吸附剂的容量是在最优条件下，单位吸附剂的量能够保留一个强保留分离物的总量。不同键合硅胶吸附剂的容量变化范围很大。选择性是吸附剂区别分离物和其他样品基质化合物的能力，也就是说，保留分离物去除其他样品化合物。一个高选择性吸附剂是从样品基质中仅保留分离物的吸附剂。吸附剂选择性是三个参数的作用：分离物的化学结构、吸附剂的性质和样品基质的组成。
固相萃取的简要过程
1.一个样品包括分离物和干扰物通过吸附剂；
2.吸附剂选择性的保留分离物和一些干扰物，其他干扰物通过吸附剂；
3.用适当的溶剂淋洗吸附剂，使先前保留的干扰物选择性的淋洗掉，分离物保留在吸附剂床上；
4.纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。
■ SPE 的方法建立
1. 选择SPE 小柱或滤膜 首先应根据待测物的理化性质和样品基质, 选择对待测物有较强保留能
力的固定相。若待测物带负电荷, 可用阴离子交换填料, 反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物, 可
用反相填料萃取。SPE 小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的
体内样品, 一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。
2. 活化 萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用5～ 10ml 溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水
溶性有机溶剂冲洗填料, 因为甲醇能润湿吸附剂表面, 并渗透到非极性的硅胶键合相中, 使硅胶更容易
被水润湿, 之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前, 应使SPE 填料保持湿润, 如果填料干燥会降低样品保
留值; 而各小柱的干燥程度不一, 则会影响回收率的重现性。
3. 加样 一般可采取以下措施: (1) 用0. 1 mol/L 酸或碱调节, 使pH < 3 或pH > 9, 离心取上层液
萃取; (2) 用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液, 以水或缓冲液稀释后萃取; (3) 用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液, 调节pH 值后萃取; (4) 超声15 min后加入水、缓冲液, 取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高, 加样前先用水或缓冲液稀释, 必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合, 然后
萃取。流速应控制为2～ 4 m löm in, 流速快不利于待测物与固定相结合。
4. 清洗填料 反相SPE 的清洗溶剂多为水或缓冲液, 可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调
节pH 值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积, 而SPE 滤膜为5～ 10 m l。
5. 洗脱待测物 应选用5～ 10m l 离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度, 则可先将洗脱液挥干后, 再用流动相重组残留物后进样。体内样品洗脱后多含有水, 可选用冷冻干燥法。保留能力较弱的SPE 填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物,再用极性较强的HPLC 分析柱如C18柱分析洗脱物。若待测物可电离, 可调节pH 值, 抑制样品离子化, 以增强待测物在反相SPE 填料中的保留, 洗脱时调节pH 值使其离子化并用较弱的溶剂洗脱, 收集洗脱液后再调节pH 值使其在HPLC 分析中达到最佳分离效果。在洗脱过程中应减慢流速, 用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱, 回收率更高。
■ 固相萃取技术在环境分析上的应用
在环境污染中农药分析的应用 国内外分析工作者就固相萃取技术在农药残留分析中的应用方面进行了广泛的尝试和探索,取得了许
多成功的经验. 由于农药在农作物生产中不仅污染作物本身,对农作物的生长环境也产生污染,包括土壤、水体等. SPE 在水体中农药残留分析方面的应用
测定水体中的农药残留一般采用如C18 ,C8 等非极性吸附剂,通常用甲醇和水条件化,以甲醇为洗脱剂.由于对水体中的农药残留限量要求严格,如欧盟规定地表水农药残留量为1.0μg/ L，饮用水为0.1μg/ L,我国规定生活饮用水中滴滴涕、六六六的限量分别为1μg/ L 和5μg/ L,而且自然水体中的农药残留质量
浓度通常也很低,若没有可靠的分离富集手段很难检测到,采用固相萃取技术可以使提取、富集和净化一步
完成. 将大体积样品过固相萃取柱进行预浓缩,用小体积洗脱剂洗脱,再浓缩定容进行检测,大大降低了检测方法的检出限. 如:康跃慧等人测定水源水中有机磷,通过固相萃取富集分离后,使方法检出限达到了1.19～5. 34 ng/L;Lopez-Blanco 等测定地表水中的硫丹(α和β异构体) ,采用固相萃取实现了样品的100 倍浓缩富集,使方法检出限达到20 ng/L; Pinto 等测定水中草净津等4 种除草剂,采用固相萃取富集样品使浓缩倍数达到500 倍,方法检出限降低至9.8～34 ng/ L.但对于水溶性强的农药品种如甲胺磷、乐果、敌敌畏等,回收率仅50 %～60 % ,甚至更低 ,因此在今后的工作中应着眼于如何提高这些农药品种的回收率,提高方法的准确度.
SPE 在土壤中农药残留分析方面的应用
测定土壤中的农药残留一般是先用适当的提取溶剂及提取方式从土壤样品中将待测的农药提取出来,再利用固相萃取技术进行净化. 由于待测农药的性质不同所使用的提取溶剂不同,因此从基质中带来的杂质性质也不尽相同,所以要选择适当的吸附剂实现待测残留农药的分离和净化.分析极性较强的农药,采用极性较强的提取溶剂如丙酮-水体系时可采用非极性吸附剂如C18等,这样提取溶剂中水溶性强的杂质不会保留在吸附剂上,有利于样品的净化,如Ruiz 等利用V (水) ∶V (DMF) = 100∶2.5 为提取溶剂、C18为吸附剂,以乙酸乙酯为淋洗剂测定土壤中莠去津,呋喃丹,地亚农等农药取得了较好的效果;而分析极性较弱的农药,采用极性较弱的提取溶剂时,可以选择极性吸附剂如Florisil 等,它不会对提取溶剂中的弱极性杂质产生保留,然后再选择适当溶剂将待测残留农药淋洗下来进行测定,如Kim 等利用V(正己烷)∶V (二氧甲烷) = 7∶3 为提取溶剂、Florisil 为吸附剂测定土壤中α,β-HCH ,七氯等有机氯农药食品有毒物质分析中的应用近两年,国外有些学者已经开始将SPE 用于食品中一些毒素的提取和净化,如食品中有机氯、有机
磷农药残留量的测定,蔬菜水果中胺基甲酸酯类、拟除虫菊酯类农药的测定,Carmichael和Aase 等人分别用C18 提取了被细菌污染的牡蛎中的麻痹毒素和致腹泻毒素,优化了这些毒素的标本提取步骤。Fiori 等人对于牛奶中非法添加的地塞米松等9 种皮质类固醇用SPE 法进行了提取,联合LC- MS 进行测定,测定水平为20～100ng/g。Skog对过高温度烧烤肉食中的致癌物质—杂环胺进行了提取,并用GC - MS 法对提取物进行测定,发现其浓度常可达10-9 水平。
有毒药物分析中的应用
固相萃取技术在有毒药物分析中的应用已不再只停留于血、尿等体液中的巴比妥类、卡马西平、安非它明类、阿片类等药物的提取和净化, Hold 等人为研究毒品在毛发中的代谢机制,将人的毛发
用酶消化后, 调pH 为5. 5 , 然后过固相柱,蒸发浓集后,联合GC - MS 同时测定毛发中的可卡因、阿片以及它们的代谢物(咖啡因,爱康宁等) ,检测限均可达到500pg/mg。
富集环境空气中痕量有机化合物
环境空气污染物中挥发性及半挥发性物质占90 % ,其余为颗粒状污染物;颗粒状污染物可用滤膜捕集,对挥发性和半挥发性一般用固相萃取(固体吸附) ,溶液吸收和低温冷凝富集采样。固相萃取富集环境空气中有机物是将均匀粒度的固定相装成小柱,在常温或低温下使空气通过小柱,由于气相(空气) 与固定相之间对有机化合物的分配系数不同而将欲捕集的化合物保留在小柱上,空气中正常组分如氮、氧等则通过小柱流出,达到富集有机化合物的目的。
■ 固相萃取及其在临床生化检验中的应用
随着生化技术的发展,从复杂的生物样品(血、尿、体液、粪便) 中提纯并富集痕量物质是现代分析技术必不可少的步骤。通过样品的预处理,去除生物样品中与待测物不相关的其他物质,并富集其浓度在可测定的线性范围内,这就要求预处理的特异性、重复性及回收率要高,而且不破坏待测物本身的性质和结构。以前常用离心、蒸馏、过滤、沉淀和真空冷冻、干燥等方法,但对复杂样品中低浓度待测物来说,上述方法难以满足要求。液-液萃取作为气相色谱( gas chromatography ,GC) 和其他色谱的预处理,曾一度非常流行,但它费时、易乳化、杂质较多、需要样品量大,并且需要一些有毒或有污染的有机溶剂,重现性和精密度较差,安全无毒的溶剂很少,且价格昂贵。为了弥补上述缺点,人们又发明了一较新的萃取方法———固相萃取(solid-phase ext raction ,SPE)，SPE 已广泛应用于各行各业,包括生物样品中各种内源性物质和外源性物质及其代谢产物的分离、纯化;药物分析中的安眠类药物、抗组胺药物、抗抑郁药物、局麻药物、兴奋药物等的检测;法医学中的毒物分析(安非他明、大麻类、有机磷、麻醉剂、氰化物等) 及环境监测中某些金属离子的测定。各种SPE 在生物分析中的应用见表
SPE 种类 典型分析类型 样品 应用
反相固相萃取 非极性物质 如烷基、芳香族等 血、尿 药物监测、氨甲喋呤、脂溶性维生素、 酚类物质多肽、胆固醇及代谢产物
正相固相萃取 极性基团物质如-OH ,-NH4 ,-O ,-S ,-N 等 血清 VitD 及代谢产物、碳水化合物、脂类分离、酚类化合物
离子交换萃取 阴离子交换 酸性物质如羧酸、硫酸、磷酸等 阳离子交换碱性物质如胺、嘌呤、嘧
啶、喋啶等 血清、尿 有机酸、脂肪酸、维生素、胆汁酸、核苷酸、磷酸、抗生素、敌鼠强 儿茶酚胺、嘌呤、嘧啶、喋呤、核苷酸、水溶性维生素、药代动力学
混合模式的SPE 反相萃取+ 阴离子交换正离子非极性物质 反相萃取+ 阳离子交换 阴离子非极性物质 反相萃取+ 阴+ 阳离子交换 非极性阴或阳离子物质 阳离子+ 阴离子交换 阴+ 阳离子
物质 血、尿、头发、体液 毒物分析如鸦片、安非他明、可卡因等;抗抑郁剂;类固醇及合成代谢产物 大麻类药物、非甾抗炎药等 复合物的分级萃取 儿茶酚胺、有机酸、碱性药物、酸性或碱性代谢物
免疫亲和SPE 药物或内源性物质 粪便、血、尿 雌激素、皮质醇、胆固醇、地塞米松、吗啡、黄曲霉素等
分子印记聚合物SPE 只与印迹相匹配的复合物 血、尿 茶碱、丁派卡因、72OH 香豆素、喷他脒及华法令、沙美利定、普萘洛尔及某些手性物质
固相微萃取(SPME) 挥发性或半挥发性物质 血、尿、粪便、
呼气 中药及代谢产物; 挥发性麻醉剂、溶剂、杀虫剂;内源性三甲胺、有机酸、类固醇、高半胱氨酸类;呼气中的异戊二烯、甲醛;大便中挥发性脂肪酸
限制基质进入的SPE 与载体内部的吸附剂相关物质 血 皮质醇、172OH2112脱氢皮质甾酮、强的松龙、氟氢可的松
金属螯合的SPE 与吸附剂相关的金属物质 水 亚氨基二乙酸与Na + 螯合测定某些金属离子
盘式SPE 根据所装吸附剂不同分析不同的物质 血、尿、全血 大麻的代谢产物如苯甲酰芽子碱、安非他明、甲基安非他明、吗啡;可卡因等抗抑郁剂脂溶性维生素
96 孔板SPE 适用于高通量的筛选及制药业 尿 雌激素的检测、甲基丙二酸的筛选、制药业的应用
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